ReadyPour™  15% Bis Tris  Solution是一种Acrylamide胶预混液，该预混液安全、快速、操作简单、解析度高

本品已預先配制成 15% 分离胶液体，按照百分之一的比例加入相应量的 10%过硫酸铵或其替代物溶液

按照千分之一的比例加入相应量的 TEMED。

例如 10ml 12% SDS-PAGE 分离胶预混液中，加入 100μl 10%过硫酸铵和 10μl TEMED

即可直接灌胶，能在10分钟以内完成凝胶（夏季3-5分钟）

凝胶时间快，无须再自行配置並节省时间

 

 

注意：

1.APS和TEMED品质的好坏会影响凝胶时间，請用新鲜配制的APS;

2.由于凝胶速度快,请勿比照传统制胶方式采用枪头转移进行灌胶;

3.灌入分离胶后記得取起制胶架轻轻拍敲桌面以利胶体键结紧实;

4.分离胶与浓缩胶之间无须用水压平,因此灌上层浓缩胶时不要在固定位点挤压灌胶;

5.抽拔齿梳时, 齿梳左右二边一定要平,轻缓慢慢拔起;

 

操作方式:

1.在挤压瓶中加入相应比例TEMED和APS后即可进行灌胶

  (等同传统计算方式:TEMED为配胶总体积的千分之一,APS为配胶总体积的百分之一)

2.取分离胶挤压瓶在玻璃板中空缝隙中选择一位点挤压灌入制作分离胶,

3.然后将整座制胶架取起,轻轻拍敲桌面两下即可

 

分离胶挤压瓶中的剩余预混液凝结成果冻状后,即代表已凝胶 

用于制备SDS Page凝胶或WB实验凝胶

 

学习Western Blot技术，首先要学习的就是手灌胶技术。

手灌胶技术是WB实验中最基本的技术，虽然现在预制胶横行天下

但是对于某些特定蛋白或比较极端分子量的蛋白，

预制胶达不到好的分离效果

有些表达量极低的蛋白预制胶胶孔达不到足够上样量

我们就需要根据待分离蛋白的特性来配制聚丙烯酰胺凝胶

 

传统制胶及步骤繁琐之处:

（1）手灌胶各成分介绍；

 

a.丙烯酰胺：形成聚丙烯酰胺的基本物质，具有神经毒性及致癌性（WB所用试剂几乎都具有强毒性，做好实验的前提，先要保护好自己）；

b.Tris-Hcl:在蛋白电泳中与Gly构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH稳定，Tris（氨丁三醇）可致癌；

c.过硫酸铵（AP）：相当于催化剂作用，提供两种丙烯酰胺聚合所必须的自由基；

d.TEMED（四甲基二乙胺）:催化过硫酸铵产生自由基，从而引发聚合反应，促进聚丙烯酰胺凝胶形成（凝固剂）,具有强烈刺激性气味（恶臭），并具强神经毒性；

e.SDS（十二烷基硫酸钠）：能使蛋白变性，具有呼吸刺激性。

（2）常用分离胶浓度与最佳分离范围；

分离胶浓度	最佳分离范围（kD）
6%	50—150/60-220
8%	30—90
10%	20—80
12%	12—60
15%	10–40

备注：分离胶浓度越大，最佳分离蛋白分子量越小。

（3）分离胶配制(两块胶量—10ml)；

成分	分离胶浓度
	6%	8%	10%	12%	15%
超纯水	5.3ml	4.6ml	4ml	3.3ml	2.3ml
30%丙烯酰胺	2ml	2.7ml	3.3ml	4ml	5ml
1.5M Tris（PH8.8）	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml
10%SDS	100μl	100μl	100μl	100μl	100μl
10%AP	100μl	100μl	100μl	100μl	100μl
TEMED	4μl	4μl	4μl	4μl	4μl

备注：我们所说的胶浓度，实际是指丙烯酰胺浓度。

（4）浓缩胶配制：

成分	4ml量	6ml量
超纯水	2.7ml	4.1ml
30%丙烯酰胺	660μl	1.0ml
1.5M Tris（PH6.8）	500μl	750μl
10%SDS	40μl	60μl
10%AP	40μl	60μl
TEMED	4μl	6μl

备注：浓缩胶一般使用2—3ml即可，浓度一般使用5%。

（5）聚丙烯酰胺凝胶配制：

a.检漏，选取清洗干净的模具玻璃，固定于胶固定器上，加入超纯水，检查模具是否漏液；

b.配制分离胶，按所需浓度配制分离胶，配制过程中最后加入TEMED，混匀后灌入模具，防止产生气泡，并注意高度，最后轻轻加入超纯水封口，使液面平整，凝固速度受室温影响，温度越高，凝固越快，冬天可放入孵箱中加速凝固；

c.待水和胶之间出现一道折线时，说明胶已凝固，此时，将水倒出，并用吸水纸吸干残余水分；

d.浓缩胶配制，按需量配制浓缩胶，同样最后加入TEMED，灌入分离胶上面，灌满模具，排气泡后插入所需梳子，待胶凝固。

胶一般提前一天配制，配制完成后，可泡到电泳液中，存放于4℃冰箱保存，第二天使用。

手灌胶技术是WB的基础入门级技术，相对于昂贵的预制胶，手灌胶性价比更高，对某些蛋白分离效果更好。

系统的掌握WB技术，依赖于预制胶远远不够，预制胶虽然节省了配胶的时间，但还是有特殊蛋白需要手灌胶进行分离。

采用快速凝胶 15% 下层分离胶预混液简易之处: 

挤压瓶中加入相应比例TEMED和APS后(等同传统计算方式),即可进行灌胶,取分离胶挤压瓶在玻璃板中空缝隙中选择

一位点挤压灌入制作分离胶,然后将整座制胶架取起,轻轻拍敲桌面两下即可