1 做荧光定量PCR之前，考虑到的是你能接触到什么机型的PCR仪，不同的PCR仪兼容的耗材以及试剂不一样的，如果你没有别人带，自己第一次做，一定要注意。

2 做荧光定量PCR最重要的莫过于，引物和模板的准备。提取RNA之后一定要电泳检测其降解状态，如果发生了降解很容易导致结果偏差；引物设计的好坏直接关系着后续实验的成功，所以引物合成回来，可以做个普通的pcr，跑电泳验证其特异性。如果同时要检测很多的基因，那么设计的时候，引物的Tm最好都相近在60度左右，扩增产物150bp左右最好，有利于操作。

3 荧光定量PCR的体系确定，大的体系容错率可能稍微高一点，小的体系对操作的精度和准度要求比较高，但是可以很好的的节省cDNA模板。如果没有电动的分液枪，要熟练的使用普通移液器。

4 进行具体实验之前，要测定引物的扩增效率，通常来说，比较两种处理中基因表达的差异是需要内参基因的，这样的比较，是假定兴趣基因引物以及内参基因的扩增效率相同且为1的。如果引物太多，可以看荧光定量PCR的扩增曲线，如果形态相近的话，一般也认为扩增效率是一致的。

5 荧光定量PCR最少设置三个技术性重复组，同时一定要有空白对照组，有很多人没有这种习惯，其实很危险。

6 荧光定量PCR的程序和普通PCR不同，会多一个melting的部分，同时三步循环中延伸的部分可以去掉，节省时间。

7 荧光定量PCR结束之后要去看下溶解度曲线，每种扩增产物的曲线为单峰既Ok

8 数据的处理，这部分首先要根据sd值判断数据质量。如果重复组数据波动很大，则会导致结果不可信，当然如果设置的重复组较多，有些明显的单个异常值可以去掉，优化数据。最后需要根据不同的目的来对数据进行不同的计算处理。