最好选择两个不同种源的抗体。选择同一种源的抗体的问题在于：在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏，从而使的抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD。假设你IP的抗体是兔抗的，目的蛋白进行WB的抗体也是兔抗的，而且目的蛋白的分子量为55KD，可以想象，55KD的位置除了你的目的蛋白以外，还有IP抗体的重链IgG。由于IP的抗体用量非常大（1ug），就导致55KD处的信号会非常强。如果你用抗兔的二抗进行显色，那么55KD处的ip抗体的重链和你的目的蛋白会重叠在一起，无法分辨。
然而这个时候如果你的目的蛋白进行WB的抗体不是兔抗的，比如小鼠抗的，那么就需要用抗小鼠的二抗进行显色，而抗小鼠的二抗是无法跟兔抗的IP抗体发生反应的。因此55KD位置的IP抗体的重链IgG就无法显色，发生反应的就是你的目的蛋白了。