ㄧ.无菌操作

细胞培养最看重的就是无菌操作，无菌操作是细胞培养是否成功的关键点。

1、使用前用75%的乙醇擦拭细胞间的桌面、超净台、孵箱和离心机等；紫外照射细胞间和超净台30分钟以上才可以进入使用。

2、进入细胞间必须穿上隔离服或者细胞间专用的白大衣，戴上手套和口罩，换上拖鞋，严格意义上来说，帽子也是要带的。除了隔离服，其他穿着物品最好一次性使用。

3、凡是放入超净台中的不是一次性使用的物品事先都需要经过高压灭菌；不能进行高压处理的物品也需要经过75%的乙醇消毒。包括酒精灯、吸管、移液器、试管架、培养皿、废液缸等。

4、操作过程中尽量接近酒精灯；用镊子拿取枪头、离心管、吸管等物品时，避免碰到使用端；不要在开口器皿的上端进行操作。

5、细胞间的设计都是一层层的隔间，每一层隔间的拉门都必须关好；当有人在超净台工作时，其他人员不允许进入操作区域。

二、培养基

1、培养基的选择依细胞种类而定。如果是从别的实验室借来的细胞，最初阶段一定要保持细胞原有的培养条件；特殊种类的细胞，比如内皮细胞，可以借鉴网上培养成功的条件，添加一些特定成分。

2、液体培养基的保存条件应是冰箱4度冷藏。小六儿见过有的大实验室细胞量多，一次性购买的培养基瓶数也多，有些人可能觉得-20冰箱保存时间会更久一些。但是经过冷冻后的培养基再溶化时，你会发现培养基的颜色发生变化，颜色变深，这就是培养基的PH值升高了。

3、培养基中都含有大量的谷氨酰胺，用来合成细胞生长所需要的核酸和蛋白质。但是谷氨酰胺在溶液中不稳定，保存4周后的培养基需要重新加入谷氨酰胺。所以尽量不要大批量购买培养，也不要一次配太多的培养基。

4、细胞适合的培养基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相对于碱性条件而言，细胞更耐酸。原代细胞对PH值的变化很敏感，而永生性细胞相对来说忍受力更强一些。

5、造成皿或瓶内培养基PH值变化的原因有很多：细胞增殖速度的快慢、孵箱内二氧化碳的浓度不准确、培养瓶的盖子拧紧或者发生了污染。如果发现细胞生长过慢，刨除细胞本身状态的原因，可以在培养液中添加丙酮酸钠（丙酮酸钠是糖酵解的中间产物，为细胞生长提供ATP，提供合成大代谢所需要的碳源，使用浓度通常是0.1mM）。

6、细胞发生污染，培养基的PH值也会发生变化。如果新配置的培养基出现沉淀，很可能是广口瓶没有清洗干净，瓶中残留的磷酸盐造成培养基成分的析出。

7、孵箱内湿度对维持培养基的渗透压也有很重要的作用。大部分细胞适应的渗透压在260-320mOsm/kg。湿度不够时，培养基蒸发，液体的渗透压就会升高。

8、培养基在使用前需提前从冰箱拿出，使其恢复至室温或者37度水浴。

9、操作过程中，如果枪头中已经有培养基或其他液体成分，不要再经过酒精灯被高温加热。高温不仅会使有效成分失效，更有可能产生有毒物质。

10、我们购买的培养基瓶上都会标注避光保存，这是因为培养基中的某些成分遇光会产生过氧化氢，具有细胞毒性。我们在超净台中处理细胞时，因为时间较短，不会产生太大问题。但是如果长时间放置在室外或灯光下照射，或者有的冷藏冰柜的门是玻璃的，就会造成培养基质量的下降。

三、血清

1、血清分为：

a)新生牛血清（新生的小牛5天内取血）；

b)小牛血清（16周内的小牛取血）；

c)胎牛血清（剖腹取出胎儿制成的）。

2、我们买来的血清多处于冰冻状态，灭活前放到4度冰箱，使其缓慢溶化。56度水浴45分钟灭活，灭活后冷却至室温再放回冰箱冷冻层中。灭活是灭活补体系统中具有蛋白酶活性的成分，对于一些难养的细胞，灭活补体是很重要的。但是灭活的温度也可能会破坏血清中的生长因子，所以到底该不该灭活血清，还没有一个很明确的标准，可能还是要视情况而定吧。

3、血清在溶化过程中，纤维蛋白原会转变成纤维蛋白，所以有时我们会看到絮状物，但是这种情况是不影响血清的质量的。

四、传代

1、贴壁细胞传代时，先用消化液润洗一遍；弃掉后，再加入适量消化液置于孵箱或镜下观察消化；当细胞变圆，彼此之间产生空隙，加入等量或大量的培养基终止消化，培养基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。

2、这里我没有明确提到胰蛋白酶的浓度，并不是说浓度越高越好。胰蛋白酶底物的特异性差，会破坏细胞膜成分。PH8.0，37度环境下，消化液的消化能力是最强的。培养基中的血清会降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反复冲洗干净培养皿。日常用的比较多的消化液浓度：a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA 

c)0.25%胰蛋白酶

3、传代后如果细胞不贴壁，可能的原因是胰蛋白酶消化过度或者没有清洗干净EDTA。

4、悬浮细胞传代时，正常收集细胞、离心浓缩、用培养基重悬就可以了。悬浮细胞每次换液都需要离心重悬，但是由于悬浮细胞一般会处于单细胞层生长，有的时候生长速度很快，重悬后如果不晃动培养皿，就会看到细胞成团；如果经常显示悬浮细胞大量抱团生长，也有可能是培养基中的血清问题、或者钙镁离子浓度的变化造成了细胞间的粘附力改变。

五、细胞死亡及生长异常

1、首先讲一下细胞生长缓慢的原因：

a)更换了血清或者培养基，细胞需要一段时间适应一下；

b)由于细胞的特殊种类，培养基中缺少某些生长因子；

c)培养基中有少量真菌或者细菌污染；

d)传代的时候细胞密度过低；

e)细胞状态老化；

f)支原体污染。

2、解决上述问题的方法：

a)如果实验室没有某种细胞最适宜的培养基，可以先用原培养条件冻存一些，然后逐渐增加新的培养基比例，25%、50%、75%到100%，传代3-5次后，让细胞慢慢适应。

b)判断是不是培养基发生污染，可以先不加抗生素，观察细胞状态。

c)增加细胞的接种密度。

d)发现细胞老化的时候，及时更换新的细胞。

e)如果怀疑是支原体污染，一定要隔离疑似污染的培养皿，及时清洁消毒孵箱。

3、造成细胞死亡的原因：

a)细胞消化过度；

b)没有及时换液，营养成分消耗殆尽；

c)如果前一天细胞的状态很好，换液之后就全死了，应该考虑是否是培养基或者血清的问题。

4、如何判定细胞是否发生支原体污染：可以选用直接培养法、荧光染色或PCR方法检测，比较常用的是PCR。当细胞发生支原体污染时，原则上是能够去除支原体的，但是整个过程耗时耗力，还要考验个人操作能力。所以如果不是处于细胞存量很少的情况下，建议发现污染时立刻弃掉，重新培养。

5、如果孵箱中只是某种细胞持续性大量死亡，而其他细胞状态都没问题的话，基本上可以确定就是孵箱存在特异性感染这类细胞的真菌或细菌，遇到这种情况，小六儿也不知道该怎么做，只能是先停一段时间看看。。。。。。

6、其他注意事项：每个星期都要更换孵箱底盘中的水（紫外照射后超纯水）；每两周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新洁尔灭擦拭一遍（都用超纯水配制）；可以在孵箱底部放一个烧杯，里面放入饱和硫酸铜，可以抑制霉菌生长。不过也有人说硫酸铜会改变孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情况很严重，建议不要使用。